Il guppy See-thru: un esempio di pesce trasparente. Estratto riassuntivo:

Il guppy possiede le principali classi di cromatofore che si trovano nei teleostei: Xanto-eritrofore, iridofore e melanofore. Queste cellule del colore rendono il corpo di un adulto sostanzialmente opaco. Un guppy trasparente è stato sviluppato, il guppy See-Thru, che riunisce in se gli alleli che geneticamente rimuovono le principali classi di celle del colore dei guppy: Xanto-eritrofore, iridofore, melanofore e leucofore. I guppy See-Thru possono avere delle interessanti applicazioni per gli scienziati che già utilizzano il guppy come organismo modello. Nella nostra ricerca sulla ereditarietà dei disegni del colore nel guppy, il guppy See-Thru può essere utile per esplorare la specificità delle mutazioni di alcuni tipi di cellule del colore.

 

Introduzione

Il guppy (Poecilia reticulata) è sempre stato di notevole interesse per la scienza a causa del polimorfismo del colore del maschio e la conseguente utilità del guppy come organismo modello per lo studio dell'ecologia evolutiva (Magurran 2005). Sono state fatte delle mappature dei legami per i geni dei guppy, ma poco è stato fatto sulla base molecolare o cellulare per i disegni dei guppy. Gran parte della ricerca che sfrutta il polimorfismo del colore nei guppy come espressione visibile del cambiamento evolutivo si basa sugli studi effettuati da Øjvind Winge negli anni 1920 e 1930, in particolare il suo documento "diciotto geni" (Winge 1927).

Gli studi esistenti dei cromatofori del guppy a livello cellulare comprendono un documento sulle mutazioni golden e blond di Goodrich (1944), che ha studiato melanofore di tipo mutante e selvatico a livello cellulare. Nel 1976 uno studio dei due tipi di cromatofore strutturali nei guppy, le iridofore e le leucofore, sono state fatte da Ikuo Takeuchi (Takeuchi 1976) usando il microscopio elettronico. Ci sono stati tre documenti sulle melanofore, nel 1978 e nel 1979, di P.L. Nayudu e C.R. Hunter, comprendenti un documento sulla risposta delle melanofore alla melatonina (Nayudu & Hunter 1979). C'è stato anche uno studio sulle iridofore del guppy nel 1982 (Gundersen e Rivera 1982).

Recentemente ci sono stati alcuni segni di un nuovo interesse per la base molecolare per i disegni dei guppy. Uno studio è stato pubblicato nel 2005 che collega un certo numero di tratti fenotipici a dei marcatori molecolari (Watanabe, e altri, 2005). Nel dicembre 2008, la rivista Zebrafish ha pubblicato un numero speciale sulla biologia del pigmento, che comprendeva uno studio degli scienziati del Max Planck Institute for Developmental Biology, sulle basi molecolari e genetiche per il polimorfismo del colore nel guppy (Tripathi, e altri, 2008).

Il pesce zebra, il Danio rerio (Hamilton), è stato l'organismo modello scelto per lo sviluppo degli studi data la della sua alta prolificità, la fecondazione esterna, lo sviluppo ex utero, la trasparenza ottica, e le avanzate conoscenze genomiche (Pickart e altri 2004). In particolare, il motivo a strisce, presente sia sui maschi che sulle femmine, ha dimostrato essere un sistema facilmente manipolabile per studiare le basi genetiche dello sviluppo nell'evoluzione della forma adulta nei vertebrati (Parichy 2001). Il guppy condivide molti di questi vantaggi, tranne la fecondazione, che è interna e l'embrione si sviluppa all'interno della femmina.

Più recentemente uno zebrafish trasparente, soprannominato "Casper", è stato sviluppato per l'analisi in vivo (White, e altri, 2008). Il zebrafish trasparente permette ai ricercatori di studiare lo sviluppo delle normali cellule staminali e di quelle tumorali nei pesci adulti dal vivo, prima questo era possibile solo in embriogenesi a causa della opacità dei pesci adulti.

Precedente alla creazione del zebrafish trasparente, un Medaka trasparente (Oryzias sinensis, Chen, Uwa & Chu) era già stato sviluppato in Giappone (Wakamatsu, e altri, 2001). Il Medaka trasparente, come il zebrafish trasparente, è "see-through" in virtù del fatto che le principali classi di cellule del colore sono geneticamente rimosse da una combinazione di alleli recessivi. La trasparenza della pelle permette agli organi interni di essere visti ad occhio nudo, o con un semplice microscopio stereoscopico. Il processo di sviluppo degli ovociti nella femmina di Medaka può essere osservato. Studi non invasivi degli eventi morfologici e molecolari negli organi interni può essere osservato per tutta la vita giovanile e adulta. Dei pesci trasparenti sono dei preziosi modelli di organismo che hanno una grande rilevanza per lo studio dello sviluppo degli organi e delle malattie negli esseri umani. I ricercatori che desiderano utilizzare i guppy come un modello di organismo per la genetica, per degli studi sullo sviluppo o sulle malattie hanno ora un guppy trasparente come opzione. Usando tre dei maggiori alleli recessivi che interessano le tre grandi classi di cellule del colore, è stato sviluppato un guppy trasparente o "See-Thru". Il guppy trasparente combina le mutazioni Albino (aa), Asian blau (rr) e Glass Belly (gbgb). Queste mutazioni geneticamente rimuovono le melanofore, le xanto-eritrofore e alcuni tipi di iridofore e leucofore dalla pelle del guppy (Figura 1).

 

Figura 1. Femmina guppy trasparente. Si può vedere chiaramente l'embrione che si è sviluppato al punto in cui la femmina è in procinto di partorire. Gli avannotti sono infatti nati il giorno successivo.

 

Il guppy See-Thru consente al ricercatore di studiare i principali organi interni dei pesci vivi: vasi del cuore, milza, sangue, fegato, intestino, gonadi, reni, cervello, midollo spinale, occhi, vescica natatoria, e branchie (figure 2 e 3 ).

 

Figura 2. Vista dal basso della femmina

 

Figura 3. Vista dall'alto del maschio

 

Materiali e Metodi.

I guppy sono stati allevati in vasche di 21 litri con cambi d'acqua manuali (30%) una volta alla settimana. Le vasche erano dipinte di nero sul fondo e inoltre non arredate. Le vadche erano mantenute ad una temperatura costante di 26 C°. Il ciclo di illuminazione era di 14 ore diurne e di dieci ore di riposo. I pesci sono stati alimentati con Artemia e con dei comuni flake commerciali per alimentare i pesci (Omega One Natural Protein Formula, Sitka, Alaska). Ogni giorno venivano somministrate un volta il cibo in scaglie e due volte l'Artemia.

 

Razze Originarie.

Due originarie razze mutanti sono state utilizzate per produrre la progenie con deficienze del pigmento. 1. Albino Blau. La razza Albino Blau è stata acquistata da Luke Roebuck, un allevatore di guppy Americano (http://ppga.tripod.com/lukesales.html). Questa razza combina l'albino con le mutazioni Asian Blau (Figura 4).

 

Figura 4. Albino Blau di Luke Roebuck

 

La mutazione albino è apparsa agli hobbisti del guppy negli anni 1940. E' stata descritta per la prima volta da Dzwillo (Dzwillo 1959). L'albinismo è il risultato del fallimento nella produzione della melanina.

La linea di Roebuck ha anche la mutazione Asian Blau. Si tratta di una mutazione precedentemente non descritta che provoca il fallimento dell'espressione delle cellule xantofore e eritrofore. Dzwillo descrive una mutazione simile, chiamata "blau" (Dzwillo 1959). Il resoconto di Dzwillo della mutazione Blau è un po' ambigua, perché dice che è una mutazione che interessa le xantofore e inizialmente non la descrive come avere influenza anche sulle eritrofore. Ma poi finisce per assegnare il simbolo "r" al gene per quella mutazione ("r" sta per rosso), adattamento da una mutazione del Medaka descritto dallo scienziato T. Aida, che è una mutazione che colpisce le cellule sia del colore giallo che del rosso. Dzwillo ci dice che il colore di base blu del corpo deriva dal fatto che le cellule di colore giallo non sono presenti nella pelle, lasciando le iridofore blu non filtrate dal pigmento giallo. (Da qui il nome. Blau è la parola tedesca per "blu"). Dzwillo descrive la mutazione come recessiva.

La mutazione Asian Blau quando eterozigote sopprime l'espressione delle eritrofore quindi è dominante. Quando è omozigote sopprime l'espressione di entrambe le eritrofore e xantofore. Per questo motivo ho esplicitato il genotipo eterozigote di un Asian Blau mutante come Ab/-. I geni albino e Asian blau insieme rimuovono due classi principali di cellule del colore nel guppy, le Xanto-eritrofore e le melanofore.

2. Glass Belly Panda. La seconda razza utilizzata per creare i guppy See-Thru era la Glass Belly Panda (Figure 5).

 

Figura 5. Glass Belly Panda

 

Questa razza è stato trovata sul sito Aquabid (www.aquabid.com) presso un hobbysta in Taiwan, Chang Yi. La razza incorpora delle mutazioni precedentemente non descritte, Moscow, Pink e Glass Belly. La mutazione rilevante è la Glass Belly (letteralmente ventre di vetro, o trasparente N.d.T.). La mutazione prende il nome dal fatto che rende il ventre trasparente. La mutazione sembra incidere sulle leucofore, che si trovano nella pelle che copre il ventre. Sembra anche di influire sulle iridofore, in particolare negli occhi, ma anche in altre zone del corpo. Essa non sembra influenzare le iridofore blu nelle pinne.

Esiste anche un ceppo che unisce la mutazione glass belly con l'albinismo (Figura 6).

 

Figura 6. Albino Red Tail Glass Belly.

 

Su Cortese concessione di Andrew Lim Si noti che nell'occhio sono mancanti le iridofore, così come nella maggior parte del corpo. La presenza di colore giallo e rosso nel corpo, e sulle pinne, indica che questo pesce non ha una mutazione che influenza questa classe di cellule del colore. La mutazione glass belly è autosomica recessiva (da dati inediti di Philip Shaddock).

 

Risultati: generazione del guppy trasparente.

Per produrre un guppy con tutte e tre le mutazioni (albino, Asian Blau, Glass Belly), dei maschi Albino Blau, dalla linea di Roebuck, sono stati accoppiati con un gruppo di femmine Glass Belly Panda vergini. Quando le femmine erano prossime al parto, una è stato selezionata e spostata in una vasca dedicata al parto. Dall'incrocio è stato ottenuto un uniforme fenotipo nella generazione F1, mostrato nella Figura

 

Figura 7. Maschio e femmina F1 dall'incrocio tra maschio Albino Blau X femmina Glass Belly Panda.

 

La generazione F1 è stata mantenuto in gruppo isolato. Quando le femmine della generazione F1 erano mature, quattro sono state selezionate casualmente per produrre la generazione F2. Da una analisi dell'incrocio si poteva predire che l'incidenza di un guppy con il genotipo aa Ab/- gbgb sarebbe stato di 1 a 16.

Le femmine partorirono tra i 13 e i 17 avannotti. Dai quattro parti solo quattro guppy ottenuti erano guppy che avevano il fenotipo trasparente: eterozigoti o omozigoti Asian Blau, albino con il ventre trasparente. C'erano tre femmine e un maschio (Figura 8). Il maschio è un albino con il ventre trasparente, su cui mancano le iridofore nel corpo e negli occhi, non avendo colore rosso, ma sembra avere del colore giallo. Ciò suggerisce che il suo genotipo sia aa Abab gbgb.

Le femmine sembravano essere di colore bianco, il che indicherebbe che sono omozigoti per il gene Asian Blau.

 

Figura 8. Maschio F2 trasparente

 

Figura 9. Due maschi F2, che mostrano un fenotipo grey con (sopra), e senza (sotto), l'allele Asian Blau. Nessuno dei due è omozigote per l'allele Glass Belly.

 

I fratelli erano della colorazione prevista. Il guppy di colore rosso in Figura 9 mostra il maschio F2 di tipo selvatico che era segregato, dimostrando che la razza originaria dei genitori aveva molto colore dovuto alle eritrofore. Il maschio F2 sotto all'altro non mostra il rosso ma invece del giallo, il che indica che probabilmente è eterozigote per la mutazione Asian Blau.

La Figura 10 mostra un maschio F2 albino senza il rosso e senza il ventre trasparente. Infine, la Figura 11 mostra una femmina che ha il ventre trasparente ma non è albina.

 

Figure 10: Maschio F2 albino eterozigote per la mutazione Asian Blau.

 

Figura 11. Femmina F2 grey con il ventre trasparente

 

Discussione

Un guppy trasparente può essere utile nei laboratori che usano già i guppy come organismo modello per lo studio dell'ecologia evolutiva, delle malattie e delle anomalie nello sviluppo degli organi interni, e nello studio nel percorso dello sviluppo dei vertebrati. La nuova razza See-Thru è di dimensioni più piccole rispetto alle razze originarie. E' robusta, e molto attiva nelle vasche. La razza sembra essere fertile. Il maschio insegue insistentemente le femmine. Abbiamo raccolto due parti dalle femmine. Nella generazione F3 il 100% degli esemplari sono del fenotipo See-thru. E' troppo presto per dire se ci sono maschi omozigoti Asian Blau. Nel nostro lavoro il See-Thru facilita lo studio delle specificità delle mutazioni del guppy per quanto riguarda le cellule di colore su cui influiscono. Ad esempio, le iridofore blu visibili nella pinna caudale del maschio F2 di See-thru (Figura 8) non sono influenzate dalla mutazione Glass Belly, mentre le iridofore nel corpo e negli occhi non riescono a svilupparsi. Eppure il maschio di razza Glass Belly originario mostra delle iridofore nella zona dorsale nella parte anteriore del corpo (Figura 5). Queste, sono assenti nel maschio See-Thru (Figura 8). La razza See-Thru sarà utile nel comprendere la mutazione Asian Blau e, ulteriormente, altre specifiche mutazioni delle cellule del colore.

 

Riferimenti

-Aquabid, 2009 http://www.aquabid.com (last view: 15.02.2009).
-Dzwillo M., 1959 [Genetic research on some domesticated strains of Lebistes reticulates (Peters)]. Mitt Hamburg Zool Mus Inst 57:143–186.
-Gundersen R. E., Rivera E. R., 1982 An ultrastructural study of the development of the dermal iridophores and structural pigmentation in Poecilia reticulata (Peters). Journal of Morphology 172(3):349-359.
-Goodrich H. B., Josephson N. D., Trinkaus J. P., Slate J. M., 1944 The cellular expression and genetics of two new genes in Lebistes reticulatus. Genetics 29(6):584–592.
-Magurran A. E., 2005 Evolutionary Ecology: The Trinidadian Guppy (Oxford Series in Ecology and Evolution). Oxford University Press.
-Nayudu P. L., Hunter C. R., 1979. Cytological aspects and differential response to melatonin of melanophore based color mutants in the guppy. Copeia 2:232-242.
-Parichy D. M., 2001 Zebrafish hybrids suggest genetic mechanisms for pigment pattern diversification in Danio. Development Genes and Evolution 211(7):319–328.
-Pickart M. A., Sivasubbu S., Nielsen A. L., Shriram S., King R. A., Ekker S. C., 2004. Functional genomics tools for the analysis of zebrafish pigment. Pigment Cell Research 17:461–470.
-Roebuck L., 2009 http://ppga.tripod.com/lukesales.html (last view: 15.02.2009)
-Takeuchi I. K., 1976 Electron microscopy of two types of reflecting chromatophores iridophores and leucophores) in the guppy, Lebistes reticulatus Peters. Cell and Tissue Research 173(1):17-27.
-Tripathi N., Hoffmann M., Dreyer C., 2008 Natural variation of male ornamental traits of the guppy, Poecilia reticulata. Zebrafish 5(4):265-278.
-Wakamatsu Y., Pristyazhnyuk S., Kinoshita M., Tanaka M., Ozato K., 2001 The seethrough medaka: A fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA 98(18):10046–10050.
-Watanabe T., Yoshida M., Nakajima M., Taniguchi N., 2005 Isolation and characterization of 43 microsatellite DNA markers for guppy (Poecilia reticulata). Molecular Ecology Notes 3(4):487-490.
-Winge Ø., 1927 The location of eighteen genes in Lebistes reticulatus. J Genet 18:1-42.
-White R. M., Sessa A., Burke C., Bowman T., LeBlanc J., Ceol C., Bourque C., Dovey M., Goessling W., Burns C. E., Zon L. I., 2008 Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell 2(2):183–189.

Received: 01 February 2009. Accepted: 11 April 2009. Published online: 12 April 2009.
Authors: Philip Shaddock, Guppy Designer, Vancouver, British Columbia, Canada, http://www.guppydesigner.com
Post adress: 1008 London St., New Westminster, B.C., Canada, V3M 3B8.
How to cite this article: Shaddock P., 2009 The See-thru guppy: a transparent fish model. AACL Bioflux 2(2):137-145.
Printed version: ISSN 1844-8143
Online version: ISSN 1844-9166 available at: http://www.bioflux.com.ro/docs/2009.2.137-145.pdf